發(fā)布日期：2018-06-14

　　6月11日，Nature子刊 Nature Medicine上同期發(fā)表了兩篇關(guān)于抑癌蛋白p53對CRISPR在人多能干細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯的影響：CRISPR基因編輯造成的DNA雙鏈斷裂會(huì)激活p53，引起人多能干細(xì)胞的凋亡。而最后被“篩選”存活的細(xì)胞，很有可能存在p53功能缺陷——多種惡性腫瘤的特征。這種細(xì)胞在移植入體內(nèi)后很可能具有極高的致癌風(fēng)險(xiǎn)，雖然尚無直接實(shí)驗(yàn)證實(shí)其致癌性。

　　這兩篇文章為CRISPR的安全性再次敲響警鐘。這提醒我們，在應(yīng)用于人體之前，CRISPR還有一段路要走。未來使用其他種類的Cas9蛋白，或是選擇性暫時(shí)抑制p53活性有可能會(huì)解決這個(gè)現(xiàn)在棘手的問題。

　　CRISPR 技術(shù)曾一度被認(rèn)為前景無量，也因?yàn)槠涓呔_度和快速的特點(diǎn)被無數(shù)人看好，希望它可以為基因治療帶來新曙光。然而，隨著各種試驗(yàn)的開展，越來越多的科學(xué)家開始質(zhì)疑這項(xiàng)技術(shù)的副作用。

　　繼去年5 月底 Nature 子刊 Nature Methods 發(fā)表的一篇文章表明“基因編輯技術(shù)有可能會(huì)在引起基因組內(nèi)數(shù)百種尚不確定的基因突變”后（于今年 4 月 27 日撤稿），6 月 11 號(hào)，發(fā)表在 Nature Medicine 兩篇文獻(xiàn)接連報(bào)道 CRISPR-Cas9 成功編輯的人多能干細(xì)胞可能存在致癌風(fēng)險(xiǎn)。CRISPR-Cas9 的致癌性仍未得到直接驗(yàn)證，但是，此次研究引發(fā)科學(xué)家關(guān)于該技術(shù)仍需優(yōu)化的討論。

　　與此前 Nature Methods 那篇基于小鼠數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，這兩篇均是來自于人多能干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這無疑給開發(fā) CRISPR 基因編輯療法的企業(yè)當(dāng)頭一棒。受此影響，CRISPR Therapeutics 股價(jià)在 6 月11 日暴跌，至今日仍未見明顯回轉(zhuǎn)。

　　根據(jù)論文，瑞典卡羅林斯卡研究所（Karolinska Institutet）和諾華（Novartis）的研究人員科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，使用 CRISPR-Cas9 成功編輯的多能干細(xì)胞很可能有 p53 缺陷，這將增加腫瘤風(fēng)險(xiǎn)。按照他們的說法，“這些基因編輯細(xì)胞就仿佛是定時(shí)炸彈一樣”。

　　在這次的挑戰(zhàn)之前，CRISPR 技術(shù)曾逃過兩次大劫——一是該技術(shù)曾被控告脫靶率出奇高，但此控告在 2017 年 4 月被撤回，二是人體對 Cas9 的免疫應(yīng)答存在問題，最終卻被敷衍為“可解決的”。不過，對于 6月11日發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們目前還無法做更多確認(rèn)。

　　CRISPR Therapeutics 公司的 CEO Sam Kulkarni 表示，這些結(jié)果“看起來是有道理的（plausible）”。盡管這些研究主要集中于用正?；蛉〈虏』虻膽?yīng)用，而非 DNA 序列剪切，他還說：“這是我們該重視的地方，尤其是現(xiàn)在 CRISPR 療法被應(yīng)用于越來越多的疾病中。我們要確保這些編輯過的細(xì)胞不會(huì)在返輸回體內(nèi)后成為癌細(xì)胞。”另一位該領(lǐng)域的領(lǐng)軍科學(xué)家（其與某基因編輯公司有密切關(guān)系，因此不便透露姓名），認(rèn)為這兩項(xiàng)研究“十分震撼人心”，并且對曾經(jīng)疏忽了這一方面的 CRISPR 療法表示了擔(dān)憂。

圖 | CRISPR 基因編輯的幾種方式（圖源：CRISPR Therapeutics）

　　另一方面，馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院（University of Massachusetts Medical School）的 Erik Sontheimer 說，其實(shí)來自諾華的那篇文章初稿自去年暑期就已經(jīng)發(fā)布了預(yù)印本，但是當(dāng)時(shí) CRISPR 界的專家們并沒有“驚慌失措”。他本人的研究方向是探究 CRISPR 技術(shù)的新型酶和脫靶效應(yīng)。他還提到：“這是一件值得注意的事，但我覺得這并不意味著 CRISPR 技術(shù)無法應(yīng)用到疾病治療中。”

　　卡羅林斯卡研究組和諾華研究組分別在人類視網(wǎng)膜細(xì)胞和多能干細(xì)胞中對 CRISPR 進(jìn)行了試驗(yàn)。兩種細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是類似的，這引起了研究人員的重視。典型的 CRISPR-Cas9 的工作原理涉及剪切雙螺旋 DNA 鏈的兩條鏈，這導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)“急救基因” p53 的活化：修復(fù) DNA 斷裂或者導(dǎo)致細(xì)胞“自殺”。然而，不論是哪種途徑，p53 活化的結(jié)果將使 CRISPR 技術(shù)無法發(fā)揮作用，因?yàn)榧羟泻蟮?DNA 鏈不是被重新連接起來就是細(xì)胞死亡。諾華研究組還證明 p53 基因的活化使得 CRISPR 在多能干細(xì)胞中的效率降低了十七分之一。這大概就解釋了為何 CRISPR 技術(shù)效率極低，即使是在病毒載體的幫助下，也只有極少數(shù)細(xì)胞的基因組被成功編輯。

圖 | 腫瘤抑制蛋白 p53（圖源：Wikipedia）

　　“我們發(fā)現(xiàn) CRISPR-Cas9 剪切基因組時(shí)會(huì)活化 p53，”卡羅林斯卡研究組的第一作者 Emma Haapaniemi 如是說，“這使得基因編輯變得更加困難。”

　　換一個(gè)角度思考，細(xì)胞能被 CRISPR 技術(shù)成功編輯，是因?yàn)?p53 功能的失常導(dǎo)致細(xì)胞失去修復(fù) DNA 的能力和失去程序性死亡的能力。但問題是 p53 功能失常也意味著癌癥的發(fā)生，并且這不是一個(gè)偶然的現(xiàn)象：幾乎一半的卵巢癌患者，43% 的結(jié)直腸癌患者，38% 的肺癌患者，將近 1/3 的胰腺癌、胃癌和肝癌患者，以及 1/4 的乳腺癌患者都具有 p53 突變。

　　諾華研究組最初的研究目的是探究如何增加 CRISPR 編輯多能干細(xì)胞的效率，因?yàn)槎嗄芨杉?xì)胞具有分化成為所有種類細(xì)胞的潛能，這樣就可以利用基因編輯來治療各種各樣的疾病。該公司在馬薩諸塞州劍橋市的研究所的神經(jīng)科學(xué)家 Ajamete Kaykas，成功將 CRISPR 技術(shù)編輯人多能干細(xì)胞 DNA 的效率提到 80%。然而，不幸的是，大部分細(xì)胞最終都沒能存活。存活下來的細(xì)胞很有可能存在 p53 功能失常，從而引發(fā)腫瘤風(fēng)險(xiǎn)。這一結(jié)論在文中的 p53 缺陷實(shí)驗(yàn)中獲得證實(shí)。

圖 |  p53 缺陷的人多能干細(xì)胞大多能“熬過” CRISPR 基因編輯，而普通的大部分都凋亡了（圖源：Nature Medicine）

　　因此，諾華組總結(jié)道：“確保 p53 在基因編輯前后都有功能這一點(diǎn)非常重要。”卡羅林斯卡研究組也認(rèn)為在使用 CRISPR-Cas9 技術(shù)發(fā)展基因編輯療法的時(shí)候需要審查 p53 和其他相關(guān)基因仍具有正常功能。

　　但是，有關(guān) p53 的這個(gè)發(fā)現(xiàn)并不意味著 CRISPR 就“玩完了”。第一，卡羅林斯卡研究所的生化學(xué)家 Bernhard Schmierer 認(rèn)為，“這兩篇文章呈現(xiàn)的只是初始數(shù)據(jù)，這個(gè)發(fā)現(xiàn)在臨床實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞中是否屬實(shí)還未清楚。”第二，p53 這個(gè)問題可能會(huì)因?yàn)槭褂闷渌?DNA 剪切酶（而非 Cas9）而減輕，此外，其他途徑的基因剪輯也可能并不涉及到 p53 活化。

　　CRISPR 編輯基因的途徑有兩種。第一種叫做非同源性末端接合 （NHEJ），或者損傷性修復(fù)，即剪切下一大段致病基因，以非同源的堿基補(bǔ)上。這是 CRISPR 治療鐮刀形紅細(xì)胞病采用的方法。第二種叫做同源性重組修復(fù)（HDR），也叫糾正性基因修復(fù)，即剪切下致病基因后以同源的正常堿基補(bǔ)上。目前，有幾所大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室正在致力于利用 HDR 來治療一些疾病，如杜興氏肌肉營養(yǎng)不良癥。

圖 | 非同源性末端接合與同源性重組修復(fù)（圖源：Emendobio）

　　Haapaniemi 說在他們組研究的正常、成熟細(xì)胞中，損傷性修復(fù)“在 p53 被活化的情況下也會(huì)發(fā)生。”這對于 CRISPR Therapeutics 鐮刀形紅細(xì)胞病等使用 NHEJ 途徑的項(xiàng)目來說是莫大的好消息。但是，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）還是在 5 月份暫停了 CRISPR Therapeutics 鐮刀形紅細(xì)胞病的人體研究。不過，p53 這個(gè)發(fā)現(xiàn)也應(yīng)該不會(huì)影響 Intellia Therapeutics 和 Regeneron 對淀粉樣變的研究。

　　根據(jù)相關(guān)科學(xué)家，賓夕法尼亞大學(xué)有關(guān) CRISPR 技術(shù)編輯 T 細(xì)胞來對抗腫瘤的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)，也不存在 p53 功能異常這個(gè)問題。其他沒有將 DNA 雙鏈打斷的 CRISPR 基因編輯照理也不應(yīng)該存在這個(gè)問題，如 Beam Therapeutics 的技術(shù)——由哈佛大學(xué)劉如謙所設(shè)計(jì)，用正確的堿基替換突變的堿基。

　　不過，p53 問題確實(shí)會(huì)影響一些企業(yè)開發(fā)的治療方法，即那些使用了 HDR 方法的，包括對肝糖儲(chǔ)積癥、囊狀纖維化和嚴(yán)重復(fù)合型免疫缺陷這些疾病開發(fā)的產(chǎn)品。

　　此外，在干細(xì)胞中使用 CRISPR 技術(shù)也成為一個(gè)棘手的問題。諾華研究組表明 p53 失常似乎在 NHEJ 和 HDR 中都是必需條件。這表明在成功編輯了的干細(xì)胞內(nèi)有失能的 p53，而這會(huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。

　　看到這兒，也許你會(huì)有疑問，為何以前沒有報(bào)道過 CRISPR 成功編輯的細(xì)胞會(huì)致癌？為何在小鼠身上的試驗(yàn)沒有出現(xiàn)致癌的結(jié)果？

　　卡羅林斯卡研究組的 Haapaniemi 解釋說，這是因?yàn)檫@種效應(yīng)出現(xiàn)在大型試驗(yàn)中，比如他們組和諾華組，而在小型研究中很容易被忽視，因?yàn)槿藗冎魂P(guān)注在一種細(xì)胞上編輯一種基因。當(dāng)問及其他科學(xué)家時(shí)，她說：“似乎其他研究組目前還沒有發(fā)現(xiàn) p53 在基因編輯中扮演的角色。”

　　來自加州大學(xué)伯克利分校的 Jacob Corn 說盡管他們實(shí)驗(yàn)室在幾次實(shí)驗(yàn)中注意到過 p53 突變的跡象，但當(dāng)他們努力追蹤這些血液干細(xì)胞在編輯后的生長效應(yīng)時(shí)卻一無所獲。不過他也表明他并沒有理由去懷疑諾華組在多能干細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)。

　　至于為何從未有人報(bào)道過 CRISPR 基因編輯會(huì)導(dǎo)致小鼠致癌，Haapaniemi 說：“這個(gè)問題問的好，”其中一個(gè)原因可能是，“實(shí)驗(yàn)小鼠一般犧牲較早”，腫瘤還來不及發(fā)生。

　　不過，Jacob Corn 說他和其他研究者“已經(jīng)在探索是否會(huì)導(dǎo)致腫瘤，但是目前沒有人發(fā)現(xiàn)相關(guān)的證據(jù)。”但是不管怎樣，他仍然覺得這兩篇文章“相當(dāng)重要，因?yàn)檫@提醒了每一個(gè)人，基因編輯并不是一種奇跡。”

　　總體而言，隨著越來越多研究表明 CRISPR 技術(shù)存在弊端，要將這項(xiàng)技術(shù)安全而高效地用于臨床治療還有很多路要走。

來源：DeepTech深科技（微信號(hào) mit-tr）